如何拍出漂亮的细胞克隆形成照片？
DU145细胞克隆形成的图片（相机左，显微镜右）
克隆形成的原理
“克隆”顾名思义，即体细胞无性繁殖，1个细胞分裂成2个细胞，并进行种群繁殖并扩大的过程，通过克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，是体外测定细胞增殖能力的一种常用技术。
克隆形成的目的
1. 评价不同杀伤因素（药物、基因等）对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性；
2. 评价细胞在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是一种模拟体内成瘤的体外实验。
克隆形成的分类
克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。
1. 平板克隆形成（Colony formation）：细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞。
2. 软琼脂克隆形成（soft agar colony formation）：细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。
下面我们就具体看一下这2种实验技术的具体操作。
一、平板克隆实验过程
将细胞分离成单细胞悬液，在培养皿中接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。
1. 具体过程：如下图所示
接种：取对数期生长的细胞以1000-4000个/孔的密度接种于6孔板；
于细胞培养箱中培养7-14天左右；
固定染色：移除培养基，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞20min；移除多聚甲醛，用0.2%结晶紫染色5min；用自来水洗涤细胞，晾干，相机拍照；
计数：计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数/接种细胞数*100%。
2. 数据分析：
显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数（大小约在0.3-1.0 mm）计算克隆形成率，并统计克隆大小。
举例：如研究某个基因对细胞增殖的影响，敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，显微镜下拍照（Scale bar=250 μm）和相机拍照，克隆的大小和数量均受到抑制[1]。
常见问题解答：
细胞密度为多少合适？
细胞接种密度与最终实验结果密切相关，若细胞太多，形成克隆数目太多，处理结果时数克隆不仅容易出错，而且图片很难看（下图左）。细胞太少，不能形成克隆。如下图所示：
上图我们看到3株癌细胞在6孔板克隆形成图片，第一个明显铺板细胞太密集，导致难以统计数据；中间那个正好，最后面那个细胞数量偏少，且细胞铺板不均匀。因此，为了获得美观的图片和准确的数据，第一次实验最好设置细胞接种梯度，如500-1000-2000-5000个/孔挑选出最合适的接种密度。细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；另外注意细胞计数时建议多计数几次。
细胞接种后培养的时间，如何确定？
通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而已异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。
细胞铺板均匀的重要性
若铺板不均匀，细胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影响统计结果，并且拍出的图片不美观，关于铺板均匀技巧可以参考往期文章。
细胞未形成克隆的原因？
并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度，加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。
计数时克隆数目较多，有什么快捷办法？
根据自身经验，只要细胞铺板均匀，我们可以选择分区计数，取平均数。此外，还可以用Image J软件进行计数。
二、软琼脂克隆形成
又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
1. 具体过程：如下图所示
配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固；
将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；
将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；
根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37°C过夜，拍照。
2. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率
举例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401和LN229中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少[2]。
常见问题解答：
上下层胶的作用是什么，为什么最后要在上层胶上再铺一层培养基？
上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物。
实验过程中琼脂温度控制在多少度？
琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块。
上层胶的细胞数目多少合适？
细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。
软琼脂克隆形成失败的原因有哪些？
细胞自身的因素，半固体环境要求细胞恶性程度高，容易生长，恶性程度低且依赖贴壁生长的细胞可能不适用于此法。
与平板克隆形成相比，各有什么特点？
平板克隆虽简单易行，但只适用于贴壁细胞，不能真实反应细胞在体内的三维生长状态。软琼脂克隆形成操作相对复杂，但更接近细胞在体内的三维生长状态，亦可用于肿瘤干细胞的培养分离，并且适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞[3]。
2种细胞克隆方式，如何选择？
根据实验对象和目的选择，平板克隆检测贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，软琼脂克隆形成实验除了检测贴壁细胞，还能检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，具有平板克隆不可取代的优势。若只是简单评价贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，则选择平板克隆即可。
综上为本期为大家介绍的2种细胞克隆形成的实验方法，它们的操作过程很简单，但是我们会遇到很多小问题，导致最终结果不理想，切记，控制接种密度，铺板均匀是2大关键点，多多联系摸索，一定会有好数据和图片哦！
参考文献
1. Wang Z, et al. Tectonic 1 contributes to the growth and migration of prostate cancer cells in vitro. Int J Mol Med (2015).
2. ChiaoPei Cheng, et al. The mechanisms of malic enzyme 2 in the tumorigenesis of human gliomas. Oncotarget (2016).
3. 张迎，袁胜利，姜鹏飞，邢世超. 两种培养方法用于乳腺癌SK-BR-3 细胞克隆形成实验的对比研究. 山东医药2010 年第50卷第51期.
肿瘤细胞生物学
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